內(nèi)毒素是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的一種脂多糖成分，是一種常見的病原體，細(xì)菌在生長(zhǎng)、分裂或死亡過程中都會(huì)向環(huán)境中釋放內(nèi)毒素。內(nèi)毒素是兩親性分子，由親水性多糖部分和共價(jià)結(jié)合的疏水性脂質(zhì)成分（稱為脂質(zhì)A）組成；多糖部分可分為兩個(gè)結(jié)構(gòu)域， 核心多糖和O特異性抗原多糖，脂質(zhì)A成分已被確定為內(nèi)毒素活性的LPS 成分。內(nèi)毒素的結(jié)構(gòu)如下圖：
生物制品在生產(chǎn)過程中常常會(huì)受到細(xì)菌內(nèi)毒素的污染，從而對(duì)生物制品造成污染，其存在會(huì)嚴(yán)重影響生物制品的質(zhì)量和安全性，進(jìn)而對(duì)人體造成嚴(yán)重危害。內(nèi)毒素通過引發(fā)炎癥和激活免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致多種生物學(xué)反應(yīng)，旨在清除入侵的致病菌，但是過度的內(nèi)毒素暴露或免疫反應(yīng)失控 可能導(dǎo)致嚴(yán)重病理生理反應(yīng)，如發(fā)熱、心動(dòng)過速、呼吸急促、低血壓、彌散性血管內(nèi)凝血和多器官衰竭等。因此，如何有效地去除生物制品中的內(nèi)毒素成為生物制品安全性與質(zhì)量保障的關(guān)鍵。內(nèi)毒素的結(jié)構(gòu)特征就是去除細(xì)菌內(nèi)毒素的基礎(chǔ)，目前已形成多種內(nèi)毒素去除工藝，包括超濾法、活性炭吸附法、萃取法、荷電微孔濾膜法、離子交換色譜法和親和色譜法等。
內(nèi)毒素作用分子機(jī)制：
細(xì)菌脂多糖是革蘭氏陰性菌的一種膜糖脂，是單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞促炎反應(yīng)的有效誘導(dǎo)劑，脂多糖結(jié)合蛋白（LBP）可與細(xì)菌內(nèi)毒素脂多糖（LPS）直接相互作用形成復(fù)合物。CD14是一種單核細(xì)胞分化抗原，被確定為 LPS 的主要受體，與 LPS 具有高親和力。當(dāng)血液中有 LPS 時(shí)，LPS 與LBP 結(jié)合，然后結(jié)合細(xì)胞表面蛋白 CD14，形成 LBP-LPS-CD14 復(fù)合體。CD14 可以將 LPS 轉(zhuǎn)運(yùn)到 Toll 樣受體 4（TLR4）及髓樣分化蛋白 2（MD2）蛋白復(fù)合體，MD2 為 TLR4 的輔助蛋白，可以幫助 TLR4 識(shí) 別 LPS，TLR4 屬于跨膜蛋白，LPS 與 TLR4-MD2 結(jié)合后，TLR4 被激活，使得膜內(nèi)基團(tuán)的構(gòu)象發(fā)生變化，將信號(hào)轉(zhuǎn)到免疫細(xì)胞內(nèi)部，激活髓樣分化因子 88 （MyD88）、IL-1R 相關(guān)蛋白激酶（IRAK）和腫瘤壞死因子受體活化因子6等信號(hào)分子，從而引發(fā) LPS 介導(dǎo)的一系列炎癥反應(yīng)。
內(nèi)毒素檢測(cè)方法：
內(nèi)毒素是一種生物類毒素與外源性致熱源，當(dāng)人體內(nèi)的內(nèi)毒素水平超過一定范圍時(shí)會(huì)對(duì)人體造成嚴(yán)重危害，所以生物制品的內(nèi)毒素檢測(cè)尤為重要。目前傳統(tǒng)的內(nèi)毒素檢測(cè)方法是家兔熱源法（RPT），即對(duì)家兔耳注射一定劑量的供試品后通過監(jiān)測(cè)家兔體溫檢測(cè)熱源即內(nèi)毒素，但這種方法不能檢測(cè)內(nèi)毒素含量。鱟試劑試驗(yàn)法（LAL）也是內(nèi)毒素的重要檢測(cè)方法之一，在領(lǐng)域內(nèi)被廣泛采用，其原理是內(nèi)毒素可以激活鱟試劑中的 C 因子、B 因子和前凝固蛋白，而使之變成凝膠狀態(tài)，可以定量或者半定量地檢測(cè)內(nèi)毒素。但是隨著鱟數(shù)量的減少，其他替代方法也相繼出現(xiàn)，如單核細(xì)胞活性試驗(yàn)（MAT）法，該方法的原理為內(nèi)毒素可以激活人單核細(xì)胞釋放白細(xì)胞介素-6（IL-6），通過用ELISA 定量檢測(cè) IL-6 進(jìn)行內(nèi)毒素的定量分析；生物傳感器是一種對(duì)生物性物質(zhì)敏感并可將其濃度或含量轉(zhuǎn)換為電信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)的儀器；重組C因子法也是一種內(nèi)毒素檢測(cè)方法，重組C因子可以被內(nèi)毒素活化，隨后和熒光底物相互作用產(chǎn)生熒光，通過對(duì)熒光信號(hào)的檢測(cè)實(shí)現(xiàn)內(nèi)毒素的定量分析。此外，還有研究人員采用色譜或色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)內(nèi)毒素進(jìn)行分析。
內(nèi)毒素的去除方法：
①超濾法：超濾法是一種分子篩選技術(shù)，主要是利用濾膜的特殊結(jié)構(gòu)和性質(zhì)實(shí)現(xiàn)對(duì)物質(zhì)的分離。內(nèi)毒素相對(duì)分子質(zhì)量較大，適用于去除小分子量物質(zhì)中的內(nèi)毒素，選用合適的超濾膜去除溶液中的內(nèi)毒素。如通?？梢赃x擇截留分子量為10 kDa 的超濾膜對(duì)樣品中的內(nèi)毒素進(jìn)行去除。超濾法具有操作簡(jiǎn)便、處理量大的優(yōu)點(diǎn)，但并不適用于含有較大相對(duì)分子質(zhì)量成分的樣品。
②活性炭吸附法：活性炭是一種多孔介質(zhì)，具有比表面積大、吸附能力強(qiáng)的特性，通過疏水作用對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量較大的內(nèi)毒素進(jìn)行吸附，在弱酸條件下去除效果更好，更適用于小分子溶液或低相對(duì)分子質(zhì)量蛋白質(zhì)或肽溶液中內(nèi)毒素的去除。但是活性炭的選擇性較差，對(duì)溶液中的活性成分也有吸附作用，并且吸附后溶液中殘留活性炭的去除較為困難，因此目前使用較少。
③萃取法：有些生物制品的有效成分為帶負(fù)電荷的生物大分子，并且含多糖結(jié)構(gòu)，細(xì)菌內(nèi)毒素不易去除，而萃取法利用目標(biāo)分子或樣品在兩種互不相溶或微溶的溶劑中溶解度的不同而達(dá)到分離目的，因此可以在細(xì)菌內(nèi)毒素去除中應(yīng)用。如可以用 TritonX-114 對(duì)內(nèi)毒素進(jìn)行萃取，TritonX-114是非離子表面活性劑，在低溫條件下， 可以溶于水中并與內(nèi)毒素分子結(jié)合，在溫度升高的過程中，TritonX-114 的溶解度會(huì)逐漸下降，當(dāng)溫度超過 25 ℃ 時(shí)，TritonX-114會(huì)和內(nèi)毒素一起形成沉淀，實(shí)現(xiàn)樣品中內(nèi)毒素的去除。
④荷電微孔濾膜法：荷電微孔濾膜是一種帶有正電荷的濾膜，能夠吸 附帶負(fù)電荷的物質(zhì)。細(xì)菌內(nèi)毒素的磷脂部分帶負(fù)電荷，因此荷電微孔濾膜可以對(duì)其進(jìn)行吸附，從而達(dá)到去除內(nèi)毒素的目的。需注意使用該方法時(shí)內(nèi)毒素的脫除率與荷電膜的孔徑及溶液的pH有關(guān)，需對(duì)這些條件進(jìn)行優(yōu)化已達(dá)到最有的脫除效率。
⑤離子交換色譜法：內(nèi)毒素在 pH ＞ 1.3 的情況下帶負(fù)電荷，因此可以利用這一原理與陰離子交換色譜發(fā)生相互作用，柱上的內(nèi)毒素可以用高鹽緩沖液或 NaOH 去除。離子交換色譜法具有成本低、吸附容量大的特點(diǎn)，但若溶液中有效成分存在其他負(fù)電荷離子，則不適合采用該方法進(jìn)行內(nèi)毒素去除，否則可能會(huì)導(dǎo)致有效成分損失。
⑥親和色譜法：親和色譜法是通過物質(zhì)之間的親和作用，運(yùn)用生物大分子可以特異性識(shí)別特定的物質(zhì)并且進(jìn)行特異性結(jié)合的原理來進(jìn)行某種物質(zhì)的分離的方法，此方法 對(duì)物質(zhì)的分離主要取決于親和配基，因此選用可以與內(nèi)毒素分子特異性結(jié)合的配基可以達(dá)到去除內(nèi)毒素的目的。研究發(fā)現(xiàn)，以多粘菌素B 、組氨酸、聚賴氨酸、絲氨酸、殼聚糖為配基的親和層析法對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素有良好的吸附效果，可以有效去除細(xì)菌內(nèi)毒素。親和層析法因?qū)?nèi)毒素有良好的選擇性，因此可有效降低溶液有效分子的損失。
原創(chuàng) 玉珠隆生物
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